В свою очередь, CRISPR-ассоциированный белок представляет собой неспецифическую эндонуклеазу (иными словами CRISPR-ассоциированную эндонуклеазу, Cas). Он направляется с помощью гРНК к локусу ДНК, где и будет производиться двухцепочечный разрыв¹  Он должен появится в одном-единственном месте генома и нигде больше — именно потому, что такие разрывы ведут к появлению мутаций. Для сравнения, размер генома человека составляет около трех миллиардов нуклеотидов, а направляющая последовательность РНК (гРНК), которая должна найти в геноме свое место посадки, имеет в длину около двадцати-сорока нуклеотидов. Удивительно, что ей вообще это удается. Если же речь идет не об отдельной клетке, а, например, о генной терапии целой ткани, то задача становится еще сложнее — все клетки должны быть модифицированы, но каждая только по одному разу²

То есть, упрощенно говоря, sgRNA – это своего рода “прицел” или “направляющие рельсы” для Cas, который представляет собой “снаряд” или “ножницы”. Их сочетание позволяет таргетно удалять определенные участки генокода для их последующей замены. Разумеется, что в рамках генной инженерии оба компонента используются совместно, образуя систему под шифром CRISPR-Cas9.

До открытия системы CRISPR/Cas9 ученые уже пытались разработать методы внесения направленных разрывов в ДНК. Например, большую работу в этом направлении проделал наш бывший соотечественник Федор Урнов. Речь идет о рациональном дизайне белков-нуклеаз, которые бы самостоятельно (без направляющей РНК) находили уникальные последовательности в геноме. Сложность с этими методами в том, что они требуют разработки под каждую конкретную задачу своего собственного белка, который затем нужно синтезировать, выделить, протестировать и т. д. Работать с универсальной нуклеазой и специфической направляющей РНК (вместе они образуют рибонуклеопротеидный (РНП) комплекс) гораздо проще, но ученые не знали о такой возможности, пока не была открыта система бактериального иммунитета²

В некоторых источниках разграничивают понятия «гидовой РНК» и «sgRNA».¹ Чаще, говоря о методах редактирования генома, мы подразумеваем под sgRNA («Single Guide RNA») единую молекулу РНК, которая содержит crRNA (CRISPR-РНК) и tracrRNA (трансактивирующая РНК). sgRNA может быть создана синтетическим путем или получена in vitro или in vivo из ДНК-матрицы. В то время как crRNAs и tracrRNAs существуют в природе как две отдельные молекулы РНК, и некоторые исследователи все еще используют вместо каждого отдельного компонента (crРНК или tracrRNA) термин гРНК.

sgRNA системы CRISPR/Cas со временем деградирует под воздействием клеточной системы защиты от свободных нуклеиновых кислот. Ферменты нуклеазы расщепляют такие молекулы, чтобы защититься от вирусов или других патогенов.
Ученые из геномного центра Нью-Йорка под руководством Алехандро Мендес-Мансилла (Alejandro Mendez-Mancilla) попытались стабилизировать эту РНК. Для этого они использовали четыре типа химических модификаций ее нуклеотидов: внесение серы, метила или обеих групп в три урацила на конце РНК, а также добавление в конец инвертированного тимидина. Все из использованных модификаций уже показали свою эффективность в стабилизации РНК в клетке.
Модифицированные последовательности проверили на генах поверхностных рецепторов клеток: CD46, CD55, CD71. sgRNA внесли в ядро линии трансгенных человеческих клеток, которые экспрессировали Cas13d. Через три дня в клетках проверили уровень мРНК генов рецепторов при помощи проточной цитометрии. Лучше всех работала sgRNA с метилированными урацилами — она позволила удалить до 80 процентов мРНК CD71. Однако эффект этой модификации был не так стабилен от гена к гену. Более стабильным оказалось добавление инвертированного тимидина — около 55 процентов для всех генов.

Исследователи считают, что модификации нуклеотидов спасают РНК от воздействия экзонуклеаз.³