Yana Slesarenko

Yana Slesarenko

  • Home
  • Pages
  • dCas9-VPR для оверэкспрессии генов

dCas9-VPR для оверэкспрессии генов

Генетика

Что такое CRISPR-Cas9?

CRISPR-Cas9 — это технология редактирования геномов, которая основана на иммунной системе бактерий и архей.
Вся технология состоит из двух блоков:

  • во-первых, особые участки бактериальной ДНК – CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats-короткие палиндромные кластерные повторы). Между этими повторами располагаются различные фрагменты ДНК — спейсеры. Спейсеры соответствуют участкам генома вируса, с которым встречалась бактерия.

Рис. 1 Область CRISPR: повторяющиеся участки чередуются с различающимися спейсерами

  • во-вторых, это Cas-белки (CRISPR-associated sequence — последовательность, ассоциированная с CRISPR), которые “вычисляют” вирус, попавший в бактериальную клетку. Если фрагмент вируса «записан» в спейсере CRISPR, Cas-белки разрезают вирусную ДНК и уничтожают ее, защищая клетку от инфекции. Известно 93 таких белка, один из которых — Cas9.

Как белок Cas узнает, что и где резать?

После того, как чужеродные генетические элементы интегрировались в CRISPR необходимо перевести их в подходящую форму для совместной работы с Cas. Для этого последовательности CRISPR транскрибируются (превращаются в молекулы РНК) и разрезаются на короткие фрагменты РНК. Такая форма РНК называется гидовой или направляющей (gRNA, гРНК) и содержат уникальные последовательности, комплементарные мишеням.

Короче говоря, sgRNA – это своего рода “прицел” или “направляющие рельсы” для “ножниц” Cas . Их сочетание позволяет таргетно разрезать определенные участки генома.
После связывания последовательности гРНК с мишенью свою работу начинает нуклеаза Cas9 – вносит двухцепочечный разрыв.

В настоящее время в большинстве исследований по редактированию геномной ДНК используется нуклеаза Cas9 в комплексе с единой направляющей РНК (single guide RNA, sgRNA). Она состоит из вариабельной crRNA (зависит от последовательности-мишени) и невариабельной tracrRNA (которая связывается с Cas9).
Но не для всех целей нужны двухцепочечные разрывы. Чтобы Cas9 разрезал только одну цепь или вообще стал неактивным в него вносятся точечные мутации и тогда возможны формы: никаза (nCas9) — режет только одну цепь ДНК и «мертвый» (dead, dCas9) — связывается с последовательностью и ничего не режет. Но такой неактивный белок можно использовать для репрессии целых наборов генов или как платформу для создания сложных регулирующих комплексов. Например, если к ней привязать активирующий домен, то экспрессия целевых генов активируется. А добавив флуоресцентные метки, можно визуализировать разные области хромосом.

Как регулировать экспрессию генов с помощью dCas9?

sgRNA позволяют активаторам dCas9 увеличивать экспрессию любого гена в геноме организма. Для этого системы активации dCas9 используют активаторы транскрипции.

Здесь важно сказать, что оверэкспрессия — это повышенная активность гена, при которой этот ген производит избыточное количество закодированного в нем белка.

Рис. 2 Схематичное изображение экспрессии и оверэкспрессии гена

До 2015 года все исследования активаторов Cas9 проводились в клеточной культуре, а активация in vivo не была показана ни на одном многоклеточном животном, поэтому китайские учёные решили впервые решили показать, как это всё работает уже на дрозофиле. Они использовали dCas9-VPR (VPR-активатор транскрипции) и несколько sgRNA на гены-мишени. И оказалось, что такой комплекс надёжно работает для активации факторов транскрипции Twist и Snail в клетках как по отдельности, так и вместе. Авторы даже адаптировали систему dCas9-VPR для активации Gal4-UAS и показали, что этот подход может активировать целевые гены in vivo на таких уровнях, которых будет достаточно для формирования доминантных фенотипов.1

Или вот например, применение активатора генов на основе dCas9 позволило увеличить экспрессию гена ламинина в мышцах мышей, больных врождённой мышечной дистрофией 1А типа (MDC1A). Для этого канадские учёные изменили экспрессию гена Lama1, используя dCas9, активаторы транскрипции VP64 и направляющую РНК для промотора Lama1. Оказалось, что введение такой конструкции новорождённым мышам вообще предотвращает разрушение мышц. При этом, даже если ввести dCas9 взрослым мышам со всеми признаками заболевания, то у них останавливается дальнейшее развитие заболевание и подвижность улучшается.2

А группа учёных из Университета Дьюка создали две линии трансгенных мышей для регуляции генов-мишеней с помощью dCas9 in vivo. Одна линия мышей Rosa26: LSL-dCas9-p300 для активации генов, а другая Rosa26: LSL-dCas9-KRAB для репрессии генов. Эти мыши позволяют исследователям изменять уровни экспрессии генов и наблюдать, как эти изменения влияют на ткани и физиологию всего живого организма.3

Что такое активаторы транскрипции

Во всех описанных выше примерах исследователи использовали в своих работах разные активаторы транскрипции. Эти активаторы транскрипции имеют белковые домены или даже целые белки, связанные с dCas9 или sgRNA, которые помогают привлекать важные кофакторы, а также РНК-полимеразу для транскрипции гена-мишени. А РНК-полимераза нам нужна, чтобы из гена получить белок, т.е для транскрипции.

dCas9-VP64

Один из первых известных активаторов транскрипции – VP64 – состоящий из четырех тандемных копий VP16. VP64 работает как сильный активатор транскрипции только при соединении с ДНК-связывающим доменом. В такой конструкции активатор транскрипции VР64 присоединен к С-концу dCas9. dCas9-VP64 считается активатором CRISPR «первого поколения» и демонстрирует умеренные уровни активации генов.

Рис.3 dCas9-VP64

dCas9-VPR

Для более высоких уровней экспрессии был разработан – VP64-p65-Rta, или dCas9-VPR – модификация dCas9-VP64. Получается, что все три фактора транскрипции нацелены на один и тот же ген и такое использование трех факторов транскрипции приводит к увеличению экспрессии генов-мишеней. Кроме увеличения экспрессии конкретного гена мы можем использовать ещё и несколько sgRNA и таким образом действовать сразу на несколько генов одной и той же клетке.4

Рис. 4 dCas9-VPR

Что интересно, в одном исследовании на дрожжах использовались различные sgRNA для нацеливания на разные части гена. И оказалось, что dCas9-VPR может действовать как активатор или репрессор, в зависимости от места его связывания в геноме. sgRNA, нацеленные на промотор (стартовая площадка для начала транскрипции), позволяют dCas9-VPR увеличить экспрессию, а нацеленные на кодирующую область гена, приводят к снижению экспрессии.5

С системой dCas9-VPR можно активно работать и в клетках Drosophila melanogaster, используя именно ее в качестве модельного организма.

Медиатор синергетической активации (SAM)

SAM использует белки MS2 , p65 и HSF1 и с их помощью система dCas9-SAM рекрутирует различные транскрипционные факторы, работающие синергетически для активации интересующего гена.

В dCas9-SAM используется модифицированная sgRNA, которая имеет сайты связывания с белком MS2. Другие транскрипционные факторы могут связываться с белком MS2, не разрушая комплекс dCas9-sgRNA.

Рис. 5 Медиатор синергетической активации (SAM)

При нацеливании на отдельные гены SAM показывает самые высокие уровни активации генов по сравнению с другими активаторами CRISPR, что делает его популярным методом для экспериментов по активации генов. Однако в случаях мультиплексной регуляции генов (одновременная активация нескольких генов) уровни активации SAM , не отличаются от других популярных методов активации (VPR и SunTag).6

SunTag

Система активатора SunTag использует белок dCas9, модифицированный для связывания с SunTag. Вместо того, чтобы использовать одну копию VP64 для каждого dCas9, SunTag использует массив повторяющихся пептидов для связывания с несколькими копиями VP64. Имея несколько копий VP64 в каждом интересующем локусе, это позволяет привлекать больше факторов транскрипции для каждого гена-мишени.

Рис. 6 SunTag

SunTag работает лучше, чем активаторы первого поколения, но показывает более низкий уровень активации, чем SAM.

Yana Slesarenko

Yana Slesarenko

Читайте также

Генетическое редактирование

Подробнее

Напишите нам

  1. Lin, S., Ewen-Campen, B., Ni, X., Housden, B. E., & Perrimon, N. (2015). In Vivo Transcriptional Activation Using CRISPR/Cas9 in Drosophila. Genetics, 201(2), 433–442. https://doi.org/10.1534/genetics.115.181065[↩]
  2. Kemaladewi, Dwi U et al. “A mutation-independent approach for muscular dystrophy via upregulation of a modifier gene.” Nature vol. 572,7767 (2019): 125-130. doi:10.1038/s41586-019-1430-x[↩]
  3. Gemberling, Matthew P et al. “Transgenic mice for in vivo epigenome editing with CRISPR-based systems.” Nature methods vol. 18,8 (2021): 965-974. doi:10.1038/s41592-021-01207-2[↩]
  4. Chavez, Alejandro et al. “Highly efficient Cas9-mediated transcriptional programming.” Nature methods vol. 12,4 (2015): 326-8. doi:10.1038/nmeth.3312[↩]
  5. Deaner, Matthew et al. “Enabling Graded and Large-Scale Multiplex of Desired Genes Using a Dual-Mode dCas9 Activator in Saccharomyces cerevisiae.” ACS synthetic biology vol. 6,10 (2017): 1931-1943. doi:10.1021/acssynbio.7b00163[↩]
  6. Chavez, Alejandro et al. “Comparison of Cas9 activators in multiple species.” Nature methods vol. 13,7 (2016): 563-567. doi:10.1038/nmeth.3871[↩]