• Home
  • Pages
  • Как сделать муху с системой dCas9?

Как сделать муху с системой dCas9?

Генетика

Оверэкспрессия гена-мишени возможна после гибридизации какого-либо из трансгенов с sgRNA одновременно с трансгеном UAS-dCas9-VPR и GAL4-драйвером. GAL4 это активатор транскрипции, с тканеспецифической экспрессией (он создаёт тканеспецифическую экспрессию Cas9-VPR, но для этого ему нужно связаться промотором UAS – для образования системы GAL4-UAS). Система GAL4-UAS – это метод, который используют для изучения экспрессии и функционирования генов в таких организмах, как дрозофила. Система состоит из двух частей: ген Gal4 (кодирует активатор транскрипции Gal4) и UAS (Upstream Activation Sequence – энхансер, с которым GAL4 специфически связывается для активации транскрипции гена). Поскольку GAL4 сам по себе невидим и мало влияет на клетки, другой необходимой частью этой системы являются линии мух со областью UAS рядом с желаемым геном. Эти генетические инструкции присутствуют в каждой клетке животного, но в большинстве клеток ничего не происходит, поскольку не происходит взаимодействия с GAL4. Однако в клетках, с GAL4, UAS активируется, ген рядом с ним включается, и он начинает производить свой белок.

Рис. 1. Схематическое изображение работы системы GAL4-UAS

Генетики создали генетические варианты модельных организмов, называемые линиями GAL4 . Эти линии экспрессируют GAL4 в различных тканях животного. Некоторые линии могут экспрессировать GAL4 только в мышечных клетках или только в нервных и т.д. Для дрозофилы существуют десятки тысяч таких линий, причем наиболее полезные из них экспрессируют GAL4 максимально специфично — например, только в нейронах, которые соединяют два определенных отдела мозга мухи. Как мы уже сказали, присутствие GAL4 само по себе практически не влияет на клетки, потому что основной эффект GAL4 заключается в связывании с областью UAS.

В клетках, продуцирующих GAL4, UAS активируется, ген рядом с ним включается, и он начинает производить свой белок. Это и говорит о том, что в клетках произошла экспрессия GAL4.

Рис. 2 Мух с экспрессией Gal4, управляющей dCas9-VPR, скрещивают с мухами, экспрессирующими sgRNA. Тканеспецифическая активация гена-мишени происходит в потомстве от скрещивания.

Для оверэкспрессии трансгены удобнее использовать в следующем порядке:

  1. Сначала будет необходимо охарактеризовать «вспомогательные» линии мух, которые несут трансгены, кодирующие активатор транскрипции dCas9-VPR. Коллекции мух представлены в Bloomington Drosophila Stock Center: #66562 и #67048.
  2. Далее нужно будет убедиться в эффективности наработки белка-активатора dCas9-VPR и отсутствии при этом токсических эффектов. Для этого будут получены мухи со следующими комбинациями трансгенов и проведена оценка их жизнеспособности:

    #1 P{y[+t7.7] w[+mC]=UAS-3xFLAG.dCas9.VPR}attP2/P{w[+mC]=GAL4-elav.L}2
    и
    #2 P{y[+t7.7] w[+mC]=UAS-3xFLAG.dCas9.VPR}attP40/P{w[+mC]=GAL4-elav.L}2.

    Здесь мы имеем интегрированный Cas9-VPR в хромосому (по сайту attP2 или attP40), находящийся под контролем промотора UAS. Именно с ним потом свяжется GAL4, который в свою очередь находится под промотором elav (обеспечивает повсеместную экспрессию в нервной ткани). Таким образом это приведёт к тканеспецифической экспрессии в нервной ткани. А y[+t7.7] и w[+mC] это маркерные гены, по которым мы сможем определить, что произошла вставка этой конструкции – тёмный цвет тела и окрашенные глаза.
  3. В связи с тем, что почти для всех отобранных генов из литературных данных известно, что они влияют на продолжительность жизни при повсеместной и/или нейрональной сверхэкспрессии, в дальнейших экспериментах планируется ограничиться только двумя драйверами:elav-GAL4 для нейрональной и tub-GAL4 для повсеместной оверэкспрессии генов. В качестве источника GAL4-драйвера для нейрональной сверхэкспрессии активатора dCas9-VPR планируется использовать линию #8765 P{w[+mC]=GAL4-elav.L}2, детально охарактеризованную молекулярно-цитологическими методами ранее. В качестве GAL4-драйвера для повсеместной экспрессии активатора dCas9-VPR планируется использовать драйвер P{w[+mC]=tubP-GAL4}LL7, имеющийся в составе линии мух #67048 P{y[+t7.7] w[+mC]=UAS-3xFLAG.dCas9.VPR}attP40; P{w[+mC]=tubP-GAL4}LL7.

Рис. 3 Драйверы: elav-GAL4 для нейрональной и tub-GAL4 для повсеместной оверэкспрессии генов

  1. Следующим этапом будет убедиться, что трансгены, экспрессирующие sgRNAs, действительно приводят к увеличению экспрессии генов-мишеней (в комбинации с dCas9-VPR и GAL4-драйвером). Для этого будут получены мухи соответствующих генотипов для каждого из анализируемых генов (таблица). У полученных мух/личинок будет проанализирован уровень экспрессии соответствующего гена-мишени с помощью процедуры обратной транскрипции и последующей количественной ПЦР. Для этого будут разработаны и заказаны соответствующие наборы пар праймеров.
  2. В дальнейшую работу будут отобраны только те трансгены, кодирующие sgRNA, которые продемонстрируют значительное изменение экспрессии генов-мишеней. Нам важны именно значительные изменения в экспрессии, которые окажут максимальное воздействие на клеточные и молекулярные процессы и то, что за этим стоит – внешние проявления. Это позволит нам точнее анализировать влияние того или иного гена на продолжительность жизни.

В последнюю очередь будут исследованы индивидуальные и комбинированные эффекты от dCas9-VPR-зависимой сверхэкспрессии генов-мишеней на продолжительность жизни мух.
  • Home
  • Pages
  • Как сделать муху с системой dCas9?
Читайте также

Генетическое редактирование

Увеличение продолжительности жизни мух за счет комбинации отдельных генов, что в последствие может быть перенесено на человека

Подробнее

Напишите нам